何叶峰 孙石静 缪芬 芳刘怡 董彦鹏 胡静雅 何海蓉

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[关键词]猪圆环病毒2型；效力；检验方法

猪圆环病毒病（PCVD，Porcine circovirus disease）是指由PCV2所引起的猪传染病，临床表现症状多种多样，如断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、猪皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）、繁殖障碍、新生仔猪的先天性震颤等，其中，PMWS、PDNS和繁殖障碍在临床上最为常见。本病于1991年在加拿大被发现，相继北美、欧洲、亚洲等全球所有养猪国家均有报道，国内1999年首次在北京、河北等地检测到病毒^[1~3]，随后多个实验室分离到PCV2；流行病学调查数据表明PCV2在猪场抗原阳性率达到了55.3%~78.3%^[4~6]。

疫苗是防控PCVD最经济有效的手段，在PCVD防制中起到了重要作用。从2010年开始在国内取得生产批准文号并上市的PCV2产品有勃林格、南农高科等10多个厂家生产的疫苗（见表1），另外还有英特威、梅里亚、硕腾、韩国komipharm等几个公司的产品已在国外销售，尚未在国内取得文号。根据抗原种类分为全病毒灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗2种，全病毒灭活疫苗毒株来源主要为当前国内流行株，如南农高科的圆克清（SH株）、武汉科前的科圆宁（WH株）、哈尔滨维科的LG株等产品；基因工程亚单位疫苗有勃林格公司杆状病毒表达的Cap蛋白。流行病学调查显示，主要流行毒株的基因型从2a亚型逐步过渡为2b亚型，这可能是PCV2流行普遍的原因；大部分试验数据表明2a与2b亚型疫苗在临床应用上效果没有明显差异，但也有个别报道2b亚型的保护效果更好^[7]。

PCVD临床表现没有猪瘟、蓝耳等疫病那么明显，主要是破坏动物机体的免疫系统，引起严重的免疫抑制，从而导致生产性能下降，常与副猪、蓝耳等多种疫病协同发病，所以其造成的危害无法用很直观的数据来描述，需要进行长期跟踪临床试验来确定其效力，这也是鉴定猪圆环疫苗效力的难点。不同生产厂家采用不同实验室方法来确定PCV2疫苗的效力，没有统一的标准或者方法，给用户选择疫苗造成很大的困扰。

表1. 国内商品化PCV2疫苗及特点

1. 抗原检测方法

PCV2疫苗效力主要通过实验室检测和临床应用评价来判断疫苗免疫效果，其中实验室检测分为检测抗原或蛋白含量、免疫后抗体效价以及攻毒保护实验。

通过抽提、冻融等方法，将疫苗中的抗原成分与佐剂分离，然后以夹心ELISA、免疫胶体金、western-blot等方法来确定抗原量，勃林格公司产品以夹心ELISA方法对抗原定量来确定疫苗效力，前提是以试验证明其抗原量与免疫效力的相关性研究；免疫胶体金和western-blot方法可大致判定抗原含量，但试验证明上述方法可因不同的血清或单克隆抗体导致结果差异比较大，另外疫苗的免疫效果不仅仅与抗原量有关，也与疫苗生产工艺、灭活剂尤其是佐剂有很大的关系。

2.抗体检测方法

抗体检测方法主要有IFA、ELISA、IPMA、免疫胶体金与中和抗体等。IFA方法一直是经典的抗体检测方法，早在2002年国内芦银华^[8]等人就利用IFA方法来检测PCV2抗体，进行流行病学调查。王忠田^[9]、琚春梅^[10]等利用表达的重组融合蛋白作为抗原，建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法，该方法的建立为我国PCV2的诊断与监测提供了技术参考。刘长明^[11]等人建立了PCV2的IPMA检测方法，并组装试剂盒进行流行病学调查。研究结果表明，用IPMA检测猪圆环病毒2型人工感染猪血清，第3～10周抗体阳性检出率为92.8%，对照组猪血清抗体检测均为阴性。与其他几种猪病毒参考血清无交叉反应，与用重组蛋白抗原建立的rcELISA符合率为89.2%。 IFA、IPMA及免疫胶体金等方法暂无商品化产品，目前 PCV2商品化的ELISA检测试剂盒有瑞普、科前、韩国金诺、荷兰百测（BIOCHEK）等。吴华伟^[12]等对国内5种试剂盒进行了比较，结果发现5种试剂盒的特异性均在90%以上，但敏感性差异较大（57%~100%），符合率较差（仅为63.2%），进口试剂盒敏感性可能更高。而不同检测方法之间在敏感性和特异性等方面也有差异。以上检测方法均用于检测猪血清抗体。

由于国内无商品化SPF猪，而且PCV2野毒感染比较普遍，很多非免疫猪自然感染下有高低不同的抗体，很难找到PCV2阴性猪，临床效力检验中无法区分抗体是由疫苗免疫还是自然感染产生，因此不能把抗体的高低作为判定疫苗免疫效果好坏的指标。SPF小鼠作为最常用的实验动物，是理想的动物试验模型，无外源干扰，能比较客观地反映疫苗免疫后的抗体水平，董信田等^[13]建立了检测小鼠PCV2抗体ELISA方法，并与免疫攻毒保护相关。相比其他抗体检测方法，中和抗体具有中和病毒、抑制病毒增殖、促使病毒被机体免疫系统清除等功能，可以确切地反映疫苗的免疫效果。

3.免疫攻毒试验

王先炜等^[14]通过攻毒保护试验来确定PCV2（SH株）灭活疫苗效力，疫苗免疫数周后攻毒，观察动物体温变化、食欲、精神状态等临床发病情况，并对肺、淋巴结等组织器官进行免疫组化，根据细胞中是否有PCV2抗原来判断疫苗是否有效；由于其需要攻毒及免疫组化，对实验设备、动物房和试验技术等要求比较高，国内少部分高校可以进行。另外，ZJ/C株采用小鼠免疫后攻毒，采取脾脏，研磨后进行病毒分离，由免疫组及对照组的分离率来判定疫苗的免疫效力。

4.临床使用效果

Park C等^[15]进行了PCV2疫苗临床使用效果的观察发现疫苗免疫后猪群生产性能有较大提高，包括提高增重情况、降低发病率、死淘率，母猪流产、死胎等；另外还可通过料肉比、用药成本、总成本、出生后仔猪母源抗体等各项数据来判断疫苗免疫效果。在实际生产过程中，不同猪场的各项统计数据的差异也不尽相同，在PCV2、蓝耳、副猪等多种疫病频发猪场，疫苗免疫后可降低发病率、死淘率及治疗成本；而在亚健康猪场，疫苗免疫后可能在提高料肉比、日增重、降低成本等方面有较为明显的体现。

Darwich等^[16]发现动物感染野毒后出现病毒血症，随着抗体产生，病毒逐步被清除；疫苗免疫后产生抗体利于动物对病毒的清除，减少病毒血症的发生或者是缩短病毒在体内的带毒时间，冯志新等^[17]建立了荧光定量PCR方法来对鼻腔拭子或者血液样品进行检测，可用于病毒血症的监测。SeoHW等^[18]通过免疫种公猪，然后以荧光定量PCR的方法监测精液中病毒的载量来判断疫苗免疫的效果。

随着养猪业规模化的发展趋势，很多集团公司对猪圆环疫苗的质量越来越重视，组建实验室或者与当地高校科研单位合作用各种试验来检验疫苗的效力，应慎重选择试验的方法，并进行科学的认证，切忌盲从。

[1]郎洪武，张广川，吴发权，等．断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测[J]．中国兽医科技，2000，30(3)：3-5.

[2]王忠田，杨汉春，郭鑫．规模化猪场猪圆环病毒2型感染的流行病学调查[J]．中国兽医杂志，2002，38(10)：3-6.

[3]秦云，林燕清，赵永旭.2001-2012年国内主要PCV2流行基因型演变趋势[J].猪业科学2013，3：86-88.

[4]李玲，李国新，周艳君，等.2008～2011年中国部分地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查[J].中国动物传染病学报，2012，20（02）：1-10.

[5]李文洁.我国部分地区猪圆环病毒2型（PCV2）分子流行病学调查[D].武汉：华中农业大学，2009：15-17.

[6]史岩.华东地区猪圆环病毒病流行病学调查与防治技术研究[D].扬州：扬州大学，2010：34-43.

[7]Seo HW, Han K, Park. C, et al. Clinical, virological, immunological and pathological evaluation of four porcine circovirus type 2 vaccines[J]. The Veterinary Journal，2014：65–70.

[8]芦银华，谈国蕾，华修国，等.应用间接免疫荧光试验检测猪圆环病毒抗体[J].中国兽医科技，2002，（8）：19-20.

[9]王忠田.猪圆环病毒2型ORF2基因表达及重组蛋白ELISA方法的建立[D].中国农业大学，2003，29-47.

[10]琚春梅，陈焕春，刘正飞.用ELISA方法进行猪圆环病毒病血清学调查[J].养殖与饲料，2003，（10）：41-42.

[11]刘长明，张超范，危艳武，等.猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用[J].中国预防兽医学报，2007，29（8）：621-633.

[12]吴华伟，高金源，邓永，等.国内5中猪圆环病毒PCV2抗体检测试剂盒的比较试验[J].中国兽医杂志，2011，45（6）：11-15.

[13]董信田，李玉峰，姜平.猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备与免疫效力研究[J].畜牧兽医学报，2008，（05）：639-644.

[14]王先炜，习向峰，季伟，等.猪圆环病毒2型灭活疫苗最小免疫保护剂量研究[J].中国预防兽医学报，2011，33（09）：723-727.

[15]Park C, Oh Y, Seo HW, et al. Comparative Effects of Vaccination against Porcine Circovirus Type 2（PCV2）and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus （PRRSV）in a PCV2-PRRSV Challenge Mode[J]l. Clin Vaccine Immunol，2013，20（3）：369-376.

[16]L. Darwich, J. Segale´s, A. Resendes. et al. Transient correlation between viremia levels and IL-10 expression in pigs subclinically infected with porcine circovirus type 2 (PCV2)[J]. Research in Veterinary Science，2008，84：194–198.

[17]冯志新，姜平，王先炜，等.猪圆环病毒2型TaqMan实时PCR检测方法的建立[J].中国病毒学，2006，（04）：371-374.

[18]Seo HW, Han K, Oh Y, et al. Comparison of three commercial one-dose porcine circovirus type 2（PCV2）vaccines on PCV2 shedding in semen from experimentally infected boars[J]. Vet Microbiol，2013，164（1-2）：145-149.